France

Mikroskop-Analyse Automatisierter Bildaufnahmeprozess sorgt für ebene Zellkulturplatten

Redakteur: Alexander Stark

Zur Kultivierung von Zellen in dedizierten Nährmedien in der Biomedizin sowie zu deren späterer Untersuchung werden Zellkulturplatten verwendet. Für die Fertigung solcher Platten ist eine zuverlässige Prozesskontrolle unerlässlich. Dies kann beispielsweise automatisiert geschehen.

Firmen zum Thema

Zellkulturplatten sind in der Biomedizin unverzichtbar, um Zellkulturen zu züchten oder organische Tests außerhalb eines lebenden Organismus durchführen zu können.
Zellkulturplatten sind in der Biomedizin unverzichtbar, um Zellkulturen zu züchten oder organische Tests außerhalb eines lebenden Organismus durchführen zu können.
(Bild: ©kazoo80 - stock.adobe.com)

In der biomedizinischen Branche ist das Anlegen und Untersuchen von Zellkulturen eine Schlüsselanwendung, sowohl in der Forschung und Entwicklung als auch in Herstellungsprozessen biotechnischer Produkte. In diesen Prozessketten sind so genannte Zellkulturplatten ein notwendiges Hilfsmittel, um Zellkulturen zu züchten oder organische Tests außerhalb eines lebenden Organismus durchzuführen. Durch die automatisierten Prozesse in der Herstellungskette ergeben sich hohe Anforderungen an die verwendeten Materialien. Auch Zellkulturplatten müssen diesen Ansprüchen genügen. Bei ihrer Herstellung müssen dadurch bedingt gewisse Toleranzen eingehalten werden. Zur Einhaltung dieser Anforderungen kann eine einfache, schnelle und – je nach Bedarf – automatisierbare Prozesskontrolle beitragen. So wird die gesamte Fertigung nachhaltig verbessert. Im Folgenden wird beispielhaft eine solche Kontrollmöglichkeit beschrieben, die auf andere Bereiche mit ähnlichen oder abweichenden Anforderungen übertragbar ist.

Drei typische Zellkulturplatten mit unterschiedlicher Wellgröße und Färbung. (Abb. 1)
Drei typische Zellkulturplatten mit unterschiedlicher Wellgröße und Färbung. (Abb. 1)
(Bild: FRT)

Die Zellkultur entsteht auf dem Boden eines so genannten Wells. Multiwell-Zellkulturplatten, mit einer typischen Plattengröße von ca. 80 mm x 120 mm, beinhalten dabei Wells. Dadurch lassen sich verschiedene Zellkulturen innerhalb einer Well-Platte anlegen, die dabei unter gleichen Bedingungen gezüchtet werden. Die Größe eines Wells variiert zwischen einem und mehreren Millimetern bis hin zu einigen Zentimetern, wie beispielhaft in Abbildung 1 gezeigt. Während der Korpus der Platten selbst ausschließlich aus geeignetem Kunststoff besteht, werden die Böden der Platten, auf denen die Zellkultur angelegt wird, häufig mit einer dünnen Folie beklebt, deren Dicke zwischen 10 µm und 1 mm liegt. Durch diese dünnen Folien treten an den Böden der Zellkulturplatten Verbiegungen und damit Unebenheiten auf.

Nach Anlegung der Zellkulturen erfolgt die Analyse ebendieser typischerweise mit Hilfe automatisierter, optischer Mikroskope. Hierfür müssen die Well-Böden, auf denen die Zellkultur liegt, auf (annähernd) gleicher Höhe liegen, damit im automatisierten Bildaufnahmeprozess der Fokus des Lichtmikroskops nicht oder nur möglichst gering nachgefahren werden muss. Hierfür darf weder die gesamte Zellkulturplatte eine zu starke Durchbiegung aufweisen, noch darf die Unebenheit der einzelnen Well-Böden zu stark sein. Dadurch ergeben sich enge Fertigungstoleranzen. Die Verbiegung der einzelnen Böden darf beispielsweise einen Wert von 10 µm nicht überschreiten.

Ebenheit als Qualitätsmaßstab

Eine Kenngröße, die für die Beurteilung der Zellkulturplatten herangezogen wird, ist die Ebenheit. Diese ist ein Maß für die maximale Abweichung der Oberfläche von einer idealen, mittleren Ebene und ist über die DIN 50441-5 und die DIN EN ISO 12781-1 festgelegt. Die Ebenheit ist ein skalarer Wert und bestimmt sich über den Abstand zweier zur mittleren Ebene parallelen Flächen, die die gesamte Topographie einschließen.

Für eine Zellkulturplatte, deren Well-Böden möglichst innerhalb eines tolerierbaren Höhenbereichs liegen, muss die Ebenheit sowohl der gesamten Platte als auch der einzelnen Well-Böden möglichst klein sein. Die Messaufgabe für ein Messsystem, welches die Produktion von Zellkulturplatten hinsichtlich dieser Merkmale kontrolliert, besteht demnach darin, die Oberflächentopographie möglichst genau und formtreu abzubilden. Aus einer solchen Oberflächentopographiemessung berechnet anschließend die Software die Ebenheit und bestimmt das Qualitätslevel der Zellkulturplatten.

Automatisierung für schnelle Prozesskontrolle

Essenziell für eine messtechnische Kontrolle ist eine geeignete Topographiemessung, die keine nachhaltigen, negativen Auswirkungen auf die Oberfläche hat. Durch die Untersuchungen an der Zellkulturplatte darf keinerlei Beschädigung oder Kontamination auftreten, insbesondere an den dünnen Bodenfolien. Jede mögliche Beeinträchtigung der Zellanhaftung an der Platte hat negative Folgen für nachfolgende Einsätze.

Eine zuverlässige Messlösung ist dabei auch auf verschiedene Zellkulturplattentypen mit unterschiedlichen Farben (transparent, schwarz, weiß) anwendbar und einfach auf variierende Geometrien der Platten und einzelnen Wells adaptierbar. Für eine fortlaufende Prozesskontrolle müssen die Messungen darüber hinaus automatisierbar und schnell sein. Die Untersuchung eines Wells innerhalb von wenigen Sekunden und Erkenntnisse über eine ganze Platte im Minutenbereich sind mit hochpräzisen Metrologielösungen zu erreichen. Für die Auswertung der Messungen ist ebenfalls eine automatisierbare Routine notwendig, um bei den gegebenen engen Fertigungstoleranzen weitestgehend unabhängig vom Benutzereinfluss zu sein.

Schnelle Profilmessungen und Toleranz-Einordnungen

Der chromatisch-konfokale Punkttopographiesensor (CWL) ist ein optischer Abstandssensor, der für die jeweilige Anwendung konfigurierbar ist. Dazu stehen Standard- und Spezialmessköpfe mit verschiedenen Messbereichen zur Auswahl. Das schnelle, zerstörungsfreie und berührungslose Verfahren des CWL arbeitet gleichermaßen zuverlässig auf stark und gering reflektierenden Oberflächen. Mit einem Messkopf, der einen vertikalen Messbereich von 600 µm umfasst, wird eine laterale Auflösung von 2 µm und eine vertikale Auflösung von < 20 nm erreicht. Damit ist der CWL-Sensor bestens für die Messung von Zellkulturplatten geeignet.

Solch ein flexibler Punktsensor – versehen mit einer lateralen Scanvorrichtung – realisiert sowohl eine 3D-Messung als auch eine 2D-Linienmessung mit variablem lateralem Punktabstand. Sowohl hochaufgelöste, detailreiche 3D-Topographiebilder als auch sehr schnelle 2D/3D-Messungen sind damit durchführbar. Auch der laterale Messbereich ist bei einem Punktsensor sehr flexibel einstellbar. Hierdurch ist die Messung von sehr kleinen Wells im Millimeterbereich, aber auch sehr großer Wells im Zentimeterbereich möglich.

Der Micro Prof 100 (Abb. 2)
Der Micro Prof 100 (Abb. 2)
(Bild: FRT)

Die FRT-Micro-Prof-Plattform stellt hierfür die ideale Grundlage zur Integration der CWL-Sensoren in ein eigenständiges Topographiemesssystem dar. Mit den Micro-Prof-Systemen lassen sich vielfältige Messaufgaben schnell, effizient und intuitiv durchführen. Insbesondere der kompakte Micro Prof 100 als „Table-Top”-Lösung (Abbildung 2) bietet sich für die Messung von Zellkulturplatten an. Mit einem xy-Verfahrtisch erreicht das Gerät mit 150 mm × 100 mm (x × y) einen für Zellkulturplatten völlig ausreichenden Verfahrbereich. Zusammen mit einem CWL-Sensor und einem CWL-Messkopf mit 600 µm Messbereich lassen sich alle notwendigen Ebenheitsmessungen auf Zellkulturplatten berührungslos realisieren. Durch Erweiterung des FRT Micro Prof 100 mit der hauseigenen Automatisierungssoftware Acquire Automation XT können sowohl die Messungen, Auswertungen als auch die anschließende Berichterstellung vollständig automatisiert ablaufen. Besonders hilfreich ist die systematische Einordnung der Ergebnisse in vordefinierte Kategorien (z. B. „Pass/Fail”). Ein für Zellkulturplatten dedizierter Probenhalter kann die Systemkonfiguration darüber hinaus weiter abrunden, wodurch der Micro Prof 100 das ideale System zur Prozesskontrolle in der Fertigung von Zellkulturplatten wird.

3D-Topographieansicht der schwarzen (links) und der weißen Zellkulturplatte (rechts) aus Abbildung 1. (Abb. 3)
3D-Topographieansicht der schwarzen (links) und der weißen Zellkulturplatte (rechts) aus Abbildung 1. (Abb. 3)
(Bild: FRT)

Abbildung 3 zeigt zwei 3D-Topographieaufnahmen der Zellkulturplatten aus Abbildung 1, die mit einem solchen Messystem erstellt wurden. In der Messung für die schwarze Zellkulturplatte sind die Unebenheit der gesamten Platte (ca. 89,3 µm) sowie der einzelnen Wells zu erkennen. Letztere können sowohl konkav als auch konvex gebogen sein, sodass die gesamte Ebenheit über alle Wells von 144,5 µm zu beobachten ist. Dass sich die beiden Werte nicht zur Gesamtebenheit von 165,0 µm summieren, liegt daran, dass sich beide Ebenheiten teilweise gegenseitig aufheben. Insgesamt lässt sich anhand der Topographiemessung sehr gut darstellen, inwieweit die Zellkulturplatte verbogen ist.

In der Messung der weißen Zellkulturplatte sind die deutlich kleineren Wells zu erkennen. Auch hier liegt die gesamte Ebenheit mit 151,2 µm bei einem vergleichbaren Wert zur schwarzen Zellkulturplatte. Durch die kleineren Wells ist die Grundplatte aber deutlich stabiler und weist mit 54,5 µm eine kleinere Ebenheit auf als die schwarze Zellkulturplatte. Dafür haben alle Wells eine konvexe Form und die Ebenheit aller Wells liegt bei 101,4 µm.

Kreuzprofil über die schwarze Zellkulturplatte (links) mit Darstellung der Durchbiegung in x- (Mitte) und y-Richtung (rechts) (Abb. 4)
Kreuzprofil über die schwarze Zellkulturplatte (links) mit Darstellung der Durchbiegung in x- (Mitte) und y-Richtung (rechts) (Abb. 4)
(Bild: FRT)

Die Messzeiten für solche vollständigen 3D-Messungen liegen bei einigen Minuten bis in etwa einer Stunde in Abhängigkeit vom gewählten Punktabstand. Im Rahmen einer Prozesskontrolle ist es allerdings wichtig, möglichst schnell eine zuverlässige Größe bestimmen zu können. Insbesondere im Falle kleinerer Wells kann der Punktabstand nicht zu groß gewählt werden, um die Wells-Ebenheit eindeutig zu bestimmen. Daher ist es für eine Messung der Ebenheiten einer Zellkulturplatte (Plattenebenheit und Wells-Ebenheit) günstiger, diese mittels Profilmessungen durchzuführen. Hierfür wird der Messvorgang in zwei Schritte unterteilt. Zunächst wird mit zwei Kreuzprofilen die Ebenheit der Grundplatte in x- sowie y-Richtung ermittelt. Abbildung 4 zeigt dies beispielhaft für die schwarze Zellkulturplatte. Bei Bedarf können diese zwei Profile noch um weitere Profile erweitert werden, z. B. Messungen über die Diagonale. Da eine solche Profilmessung nur wenige Sekunden Messzeit beansprucht, kann die Ebenheit der Grundplatte somit in weniger als 30 Sekunden bestimmt werden.

Sternprofil über einzelnen Well der schwarzen Zellkulturplatte (links) und Darstellung der Durchbiegung pro Profil (rechts) (Abb. 5)
Sternprofil über einzelnen Well der schwarzen Zellkulturplatte (links) und Darstellung der Durchbiegung pro Profil (rechts) (Abb. 5)
(Bild: FRT)

Für die Ebenheitsmessung der einzelnen Wells wird in einem zweiten Schritt auf jedem Well ein Sternprofil gemessen, wie in Abbildung 5 dargestellt. Aus diesen vier Profilen wird eine Gesamtebenheit für jeden Well bestimmt und diesem somit je ein Ebenheitswert zugeordnet. Damit die Profile – wie gezeigt – mittig auf jedem Well liegen wird die Position der Zellkulturplatte vorab mittels einer Kamera automatisiert bestimmt und die Messpositionen anhand dessen ausgerichtet. Abbildung 6 zeigt das Ergebnis dieser automatisierten Messung mit der Falschfarbendarstellung der Ebenheit pro Well. Hier ist zu erkennen, dass am rechten Rand der Zellkulturplatte die Ebenheit besonders hoch ist. Außerdem ist dort die höchste Verbiegung mit 89,5 zu erkennen. Die Messzeit für ein solches Sternprofil beträgt ebenfalls nur < 2 Sekunden pro Well. Die Gesamtmesszeit pro Well-Platte hängt dabei im Wesentlichen von der Anzahl der Wells bzw. deren Größe ab.

Darstellung der Einzelergebnisse der Ebenheit pro Well für die schwarze Probe (links) sowie Einordnung in Pass/Fail-Klassen (rechts, Ebenheit > 20 m wird als „Fail“ klassifiziert). (Abb. 6)
Darstellung der Einzelergebnisse der Ebenheit pro Well für die schwarze Probe (links) sowie Einordnung in Pass/Fail-Klassen (rechts, Ebenheit > 20 m wird als „Fail“ klassifiziert). (Abb. 6)
(Bild: FRT)

Da für die Güte einer Zellkulturplatte eine niedrige Ebenheit pro Well gefordert wird und es hier typischerweise vorgegebene Toleranzwerte gibt, macht es Sinn, dass das Messsystem die Ergebnisse direkt mit diesen Toleranzen vergleicht. Dargestellt ist in Abbildung 6 auch die Einordnung der ermittelten Ebenheiten in „Pass/Fail“-Klassen. Dabei ist ein Well durchgefallen, sobald die Ebenheit die Toleranz von 20 µm überschreitet. Dieser wird entsprechend in Rot dargestellt. Basierend auf dieser Klassifizierung der Wells kann dann unter Einbezug der zuvor ermittelten Gesamtplattenverbiegung die Zellkulturplatte als solche ebenfalls einer Klasse zugeordnet werden. Auch das kann das System selbstständig vornehmen. Am Ende erhält der Anwender einen Bericht in Form einer pdf-, einer csv- oder einer xml-Datei zur Dokumentation. Optional können die Ergebnisse sogar in eine SEGS/GEM-Umgebung hochgeladen werden.

Hierdurch lassen sich mit dem Micro Prof 100 mit FRT-CWL-Sensor Zellkulturplatten vollständig automatisiert inspizieren, d. h. Messung der Topographie, Auswertung der Ebenheit und Erstellung der entsprechenden Berichte mitsamt Klassifizierung. Darüber hinaus ist die FRT-Micro-Prof-Plattform modular um weitere Sensoren und Software erweiterbar, wodurch der Anwender Zugang zu weiteren Messgrößen erhält. So lässt sich mit dem CWL-Sensor auch die Rauheit von Oberflächen bestimmen und eine Ergänzung des CWL-Sensors durch einen Schichtdickensensor ermöglicht die Messung der Foliendicke der Zellkulturplatten. Dadurch kann eine Vielzahl von Messaufgaben auf demselben System realisiert werden, nicht nur auf Zellkulturplatten.

Vielfältige Optimierungsmöglichkeiten dank optischer Metrologie

Effektive Forschung, Entwicklung und Produktion in der Medizinbranche verlangen nach außerordentlicher Präzision, Genauigkeit und Wiederholbarkeit. Ob für akut forschungsrelevante Begebenheiten, wie die Suche nach neuen Wirkstoffen, oder eine routinemäßige Qualitätssicherung, verlässliche Methoden zum Messen und Bewerten von grundlegenden Produkteigenschaften sind stets erforderlich. Für die Analyse von Zellkulturplatten ist die optische Messtechnik ein geeignetes Instrument, das topographische Eigenschaften erfassen und mit anschließender Auswertung qualifizieren kann. Im Hinblick auf die ständig wachsenden Anforderungen werden durch messtechnische Werkzeuge oft vielfältige Optimierungsmöglichkeiten offengelegt.

Weitere Artikel über Auftragsfertigung und Fertigungseinrichtungen finden Sie in unserem Themenkanal Fertigung.

(ID:47486097)